合成生物学探究真核细胞膜脂起源谜题

　　生命之树分为三个领域：细菌（Bacteria）、真核（Eukarya）及古菌（Archaea）。1977年，美国微生物学家Carl Woese通过16S/18S rRNA序列系统发育分析偶然发现了古菌，据此将原核生物分为两大类：细菌和古菌，与真核生物一起构成了生命起源的三域系统生命树假说（Three-Domain）。1988年，James Lake基于核糖体结构类似性及进化简约性分类方法，揭示了真核生物是古菌的一个分支，暗示着真核生物可能来源于古菌，提出了二域系统生命树假说（Two-Domain）。古菌是单细胞原核微生物，无细胞核、无内膜系统、具备环状基因组及缺乏剪接体内含子，在细胞结构、代谢方面与细菌接近；但在DNA复制、转录和翻译等生物学中心过程上，则与真核生物更密切。人类属于真核生物。古菌是真核生物的兄妹（三域假说），还是父母（二域假说）？这是生命演化的重大问题之一。 

　　宏基因组技术的发展导致了Asgard古菌的发现，许多Asgard古菌的基因组携带大量真核标记蛋白（Eukaryotic Signature Proteins，ESP）编码基因，在演化关系上是目前与真核生物起源距离最近的原核生物。Asgard古菌的发现被认为倾向支持二域系统生命树假说：约在18-20亿年前，Asgard谱系的古菌祖先首先获得了原始的细胞骨架系统，具有膜变形和核内体物质分选运输的能力，然后与alpha变形菌门的细菌发生了“内共生”，并逐渐进化成现代真核生物中最重要的细胞系-线粒体，成为真核生物起源的关键一步。 

　　然而，内共生学说也面临许多挑战，其中一个重要的未解之谜，是为何现存组成真核细胞与古菌细胞的细胞膜脂分子骨架具有相反的手性？现代细菌和真核细胞的膜脂主要由甘油-3-磷酸（sn-glycerol-3-phosphate，G3P）为骨架，而古菌细胞膜则以甘油-1-磷酸（sn-glycerol-1-phosphate，G1P）为基本母核结构，这一现象被称为膜脂分界（Lipid Divide）。这一现象极其不同寻常，因为组成地球生命的有机分子通常具有单一手性，如L型氨基酸、D型核苷酸等。基于内共生理论，现代真核细胞应该来源于古菌宿主，但是其细胞膜脂的手性却与古菌相反、与被内吞的细菌类似。膜脂分界和二域生命树看似存在不可调和的矛盾，这是真核起源的重大谜题之一。在之前的研究中，科学家们基于脂质体（liposome）、细菌等构建了兼具G1P和G3P的杂合膜脂模型，但尚未成功构建真核-古菌杂合模型，以更直接的研究真核膜脂起源的问题。 

　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种模式真核微生物，具有详尽的遗传生化研究和丰富的合成生物学工具，是研究古菌-真核膜脂演化的理想宿主。依托合成生物“大设施”，作者采用模块化DNA组装方法，规模化构建了古菌细胞膜极性脂的生物合成通路，在酵母底盘中“即插即用”式引入产甲烷古菌、硫化古菌、Asgard古菌等不同来源的关键合成基因，成功合成了具备古菌醚键特征的极性脂（图1）。基于这一模型，作者发现酿酒酵母中竟然也具有合成G1P能力。与此同时，作者首次获得生化实验证据，支持Asgard古菌来源的GGGPS、DGGGPS酶可以合成兼具G1P、G3P手性的杂合膜脂（图 2）。这些观察说明膜脂分界并非像人们原来认为的那样严格。 


图 1 重组酵母中古菌特征脂类合成途径（蓝色背景）及酵母内源脂类合成途径（黄色背景）。 


图 2 a，重组酵母Gty-Ma脂类合成，离子峰1-4：古菌极性脂；蓝色背景离子峰：5，不饱和古菌醇DGGGOH；其他，DGGGO-FAs；黄色背景离子峰：酵母内源TAG。b，古菌细胞膜极性脂类合成关键酶/通路功能表征。 

　　值得注意的是，作者在重组酵母中意外发现了一系列中性脂分子（图2，蓝色背景离子峰）。作者利用NMR、高分辨质谱、串联质谱等多种分析手段，指认该类化合物的分子结构为新颖的杂合中性脂DGGGO-FAs，同时含有古菌醚键特征和细菌脂肪酰基特征。基于基因敲除、回补等方法，作者探究了DGGGO-FAs的生物合成机制，发现酿酒酵母中二酰甘油酰基转移酶DGAT是关键合成酶，催化DGGGOH古菌醇和Acyl-CoA缩合产生DGGGO-FA。 

　　令人兴奋的是，作者在古菌蛋白数据库中开展DGAT序列同源检索，发现其同工酶序列在古菌域中广泛分布。作者选取了来源于深古菌门（Candidatus Bathyarchaeota）、广古菌门（Euryarchaeota）的DGAT序列，通过在酵母中异源表达，证明了古菌DGAT酶具有合成DGGGO-FA的能力，同时也可催化合成TAG分子。自然界中，聚羟基脂肪酸酯（PHA）、TAG及蜡酯（Wax Ester）等中性脂通常被用于能量贮存，其中真核及细菌主要利用PHA、Wax Ester和TAG、古菌主要利用PHA。本研究中，作者首次证明古菌中广泛存在DGAT酶（图 3），并通过生化实验证明其合成DGGGO-FAs的能力，有望改写科学界对古菌能量储藏形式的认知。然而，尚不清楚自然环境中古菌能否合成DGGGO-FA类中性脂，因此本研究提出的假说仍有待于进一步验证。 


图 3 DGAT同工酶在细菌、真核及古菌域中广泛分布。 

　　总之，真核生命起源依然有许多争议和未解之谜，而合成生物学可以提供新思路和新方法。本研究的局限之一是酵母模型中古菌细胞膜极性脂的含量仍然较低，未能令人信服的回答杂合细胞膜能否在真核细胞中稳定存在的问题。未来，作者计划结合代谢工程等方法，提高古菌膜脂异源合成效率，研究膜脂手性对于真核细胞生理、脂类亚细胞定位等关键生命过程的影响，持续探究真核细胞膜脂起源和演化的谜题。 

　　中国科学院深圳先进技术研究院张建志助理研究员为第一作者，司同研究员为通讯作者。 

　　该研究得到了国家重点研发计划（2021YFA0910800和2020YFA0908500）、国家自然科学基金（32101179, 32071428, 91851210）、海洋地球古菌组学深圳市重点实验室（ZDSYS201802081843490）和南方海洋科学与工程广东省实验室(广州)的资助，同时，也得到了深圳合成生物学创新研究院的支持。