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青岛能源所基于单细胞拉曼开发免分离培养的快生长蓝细菌筛选方法
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分类:  创建于:2023-12-12 被查看:989次
  作为一种光能驱动的合成生物学底盘细胞,蓝细菌能将阳光、海水和二氧化碳直接转化为各种生物基产品。而如何快速识别和筛选到生长速度快的工程菌株,实现各种逆境条件下从二氧化碳到生物质的高效转化,是蓝细菌合成生物技术的共性需求。但是,目前蓝细菌生长速度的评估手段,主要通过菌株分离培养后细胞数目或生物量累积量的监测,这一过程非常耗时、耗力与繁琐,已成为蓝细菌工程化开发和应用的限速步骤之一。针对这一瓶颈问题,青岛能源所基于原创的单细胞拉曼分析分选装备,开发了不依赖于细胞分离培养、单细胞精度的快生长蓝细菌筛选方法(iCyanVS),并从混合突变体库中直接识别和获取到在高盐环境下仍强劲生长的工程蓝藻单细胞。该研究发表在Synthetic and Systems Biotechnology《合成和系统生物技术》。


  13C标记的单细胞拉曼光谱可在单个蓝细菌细胞精度,不依赖于细胞扩增繁殖而快速地测量生长速度、固碳速率等关键代谢表型,并通过RACS-Seq等单细胞拉曼分选仪,在单细胞精度追溯导致了这些表型的相应基因型   

  蓝细菌是唯一一类进行光合作用的原核生物,也是生物圈中重要的初级生产力贡献者。与高级植物相比,蓝细菌具有较短的生命周期、更快的生长速度和更高效的光合作用,因此可作为光能驱动的底盘细胞,将太阳能和二氧化碳转化为各种生物基产品。在环境压力下仍能快速生长和高效固碳的蓝细菌菌株是这些光驱细胞工厂在实际工业环境中大规模应用的遗传种质基础。因此,如何迅速且可靠地从自然环境或突变库中识别和获取具有这些工业表型的菌株,备受业界关注。

  单细胞拉曼光谱能够在单细胞精度表征细胞群体的底物代谢、产物合成、药敏性、环境应激等关键代谢功能。因此,由来自微生物制造工程中心与单细胞中心的博士后崔金玉、博士生陈荣泽和孙绘梨组成的联合攻关小组,基于拉曼组原理和前期自主研制的单细胞拉曼光镊分选仪(RACS-Seq),利用耦合稳定同位素标记的单细胞拉曼光谱技术,提出了一种无需分离培养、单细胞分辨率、表型结合基因型的快生长蓝细菌筛选策略,称为“蓝藻个体活力检测与筛选”(iCyanVS)。

  首先,研究小组证明,蓝细菌细胞群体中,基于单细胞拉曼光谱表征的细胞个体中类胡萝卜素分子的13C掺入比率,可区分和测量细胞个体的生长速率和二氧化碳固定速率。因此,在不依赖于细胞生长或增殖的前提下,通过12小时的13C标记碳酸氢根孵育,即可基于单细胞拉曼光谱,测量蓝细菌单细胞的生长速率。

  进而,在人工构建的混合突变体库中,利用RACS-Seq仪器,基于单细胞拉曼光谱,在10分钟之内检测了135个蓝细菌单细胞在高盐条件下的碳固定速率及其生长速度,并确定了其中表型处于前10%的蓝细菌细胞个体。最后,运用该仪器上的全液相单细胞拉曼分选芯片,分别追溯了上述11个优良表型单细胞的基因型。研究发现,对应于上述快生长速度表型的基因型,是过表达了一个全局基因关键转录因子rpoD1。进一步,纯菌株层面的实验则验证了该基因型突变株在高盐条件下保持高生长速度(比野生型高44%)的出色性状。

  与之相比,通过传统方法筛选高生长速率的蓝细菌突变株,需20天的纯化培养,再加上5天的生长曲线监测,总共耗时长达25天。因此,iCyanVS在单细胞精度进行生长速度、固碳速度等关键工业表型的筛选和基因组追溯,可以规避耗时耗力的工程菌株纯化培养与生长曲线监测等环节,将大大提升蓝细菌种质开发的效率和通量。除了RACS-Seq仪器,这一新技术也已经整合入单细胞中心研制的高通量流式拉曼分选仪FlowRACS,服务于快生长或高固碳光合细胞工厂的高通量筛选。

  本工作由青岛能源所微生物制造工程中心吕雪峰研究员、栾国栋研究员、单细胞中心徐健研究员共同主持完成。获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院青促会、山东省博士后创新项目、中科院博士后科学基金、中科院洁净能源创新院合作基金和山东省泰山学者计划的资助。(文/陈荣泽 图/刘阳)

  原文链接:https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.11.001

  Jinyu Cui#, Rongze Chen#, Huili Sun#, Yingyi Xue, Zhidian Diao, Jingyun Song, Xiaohang Wang,Jia Zhang, Chen Wang, Bo Ma, Jian Xu*, Guodong Luan*, Xuefeng Lu*. Culture-free identification of fast-growing cyanobacteria cells by Raman-activated gravity-driven encapsulation and sequencing. Synthetic and Systems Biotechnology, 2023, 8(4):708-715.
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