CRISPR-Cas9、碱基编辑器（base editor）和CRISPR激活（CRISPRa）已经迅速应用于基础研究和作物改良领域。然而，在实践中，这些工具通常被单独使用。鉴于每个工具都有其自身的能力和限制，将这些功能组合起来，以最大化其基因组工程潜力是非常有吸引力的。然而，在植物领域中，多重正交基因组编辑和转录调控的组合方法尚未被探索和应用。

近日，浙江大学农业与生物技术学院潘长田研究员与美国马里兰大学帕克分校（University of Maryland, College Park）戚益平教授团队合作，在Nature Protocols在线发表了题为《CRISPR-Combo–mediated orthogonal genome editing and transcriptional activation for plant breeding》的方法学文章。本研究在先前开发的植物新型多重基因转录激活系统CRISPR-Act3.0（发表于Nature Plants, 2021）的基础上，创新地开发了一种利用单个Cas9蛋白在同一细胞或植株中实现正交基因编辑（敲除或者碱基编辑）与转录调控的双功能CRISPR新系统，即CRISPR-Combo（发表于Nature Plants, 2022）。本文详细描述了CRISPR-Combo的构建方案，并展示了该系统在植物育种中的应用潜力。


CRISPR-Combo系统由两个子系统Cas9-Act3.0和CBE-Cas9n-Act3.0共同组成。Cas9-Act3.0通过单个Cas9核酸酶实现正交DNA双链断裂依赖的靶点突变和定向转录激活。CBE-Cas9n-Act3.0则通过单个Cas9n切口酶实现正交C-to-T单碱基编辑和定向转录激活。本论文首先介绍了Cas9-Act3.0和CBE-Cas9n-Act3.0的工作原理，以及与现有技术相比的优势和在植物研究中的潜在应用场景。

紧接着，文章系统地描述了三种不同功能（靶向敲除、单碱基编辑、激活）sgRNA的设计原则和方法，并介绍了将多个sgRNA和Cas9蛋白载体组装到最终T-DNA载体上的策略。本论文利用CRISPR-Combo系统通过激活成花素基因FT，提出了一种靠开花表型快速筛选并获得非转基因突变体的新型育种策略。此外，利用CRISPR-Combo系统激活形态发生基因OsBBM1，在水稻中首创在无外源激素模式下实现转基因水稻再生，而且该策略能显著提高第一代转基因植株纯合突变体比例。该论文证明了CRISPR-Combo系统的多功能性，并为现代植物育种方法的创新提供了技术支持。


农学院研究员潘长田是该论文的第一作者和通讯作者，美国马里兰大学帕克分校的戚益平教授为共同通讯作者。浙江大学是本文的第一通讯作者单位。该研究得到了国家自然科学基金、国家级人才项目以及浙江大学上海高等研究院繁星科学基金等项目的资助。