胃癌是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，具有强烈的肿瘤异质性，在临床上常表现为多样的组织病理学类型。例如，按照最新的WHO消化系统肿瘤分类，胃癌包括管状腺癌、乳头状腺癌、低粘附癌、印戒细胞癌、神经内分泌癌以及肝样胃癌等多种病理类型。其中混合型胃癌是高度肿瘤内部异质性的典型代表，同一个肿瘤中至少含有两种以上病理成分，且更容易复发和转移。然而，目前基于组织病理学的胃癌分型在指导临床治疗中发挥的作用仍然有限，关键原因是目前对胃癌不同病理亚型的分子特征认知不足，这是亟待进一步探究的方向。

4月12日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北大-清华生命科学联合中心汤富酬教授课题组与合作者在National Science Review期刊发表了题为“Integrative single-cell multiomics analyses dissect molecular signatures of intratumoral heterogeneities and differentiation states of human gastric cancer”的研究论文。


论文截图

在该研究中，研究人员利用胃癌根治性手术切除标本，收集配对的癌旁、原发灶、淋巴结转移灶并对每个肿瘤部位进行多点采样，对来自14例胃癌患者的85个样品进行了优化的单细胞多组学【基因组（拷贝数变异）、DNA甲基化组、染色质状态组、以及转录组】测序（scTrio-seq3），并结合同一采样位点的组织病理学分型结果进行了系统、深入的数据整合分析，精准绘制了胃癌的单细胞DNA甲基化图谱，揭示了混合型胃癌不同分化状态癌细胞的多个组学层面的关键分子特征以及免疫微环境特征，有望为胃癌的临床诊断和治疗提供新的理论依据。


实验设计

该研究的主要发现如下：

1、揭示了不同胃癌患者癌细胞基因表达异常的共性规律

该研究筛选出334个在14例胃癌患者的癌细胞中普遍上调的基因以及82个普遍下调的基因。通过与癌旁正常胃上皮细胞以及结直肠癌癌旁正常肠上皮细胞的系统比较，发现胃癌异常上调基因中有26个是肠上皮细胞特异高表达的基因，例如TFF3、CLDN3、CLDN4、CLDN7、TMEM176A、TMEM176B和MUC13等。这不仅发生在肠型胃癌中，也发生在弥漫型以及混合型胃癌中。同时，一些正常胃上皮细胞特异性表达并参与行使胃正常生理功能的基因在胃癌细胞中普遍显著下调，例如PGA3、PGA5、PGC、LIPF、GKN1、GKN2、MUC1、MUC5AC和MUC6等。这说明胃癌的肿瘤发生过程中上皮细胞发生去分化，失去部分正常胃上皮的基因表达特征和正常生理功能。同时，由于这些癌细胞的可塑性增加，因而异常表达了数十个肠上皮高表达基因。因为在正常发育过程中，胃上皮和肠上皮来自共同的消化道上皮前体细胞，胃癌细胞异常表达部分肠上皮特异性基因说明胃癌细胞失去部分分化特征的同时获得了很强的可塑性，这对理解胃癌易复发、易耐药的特征提供了新的研究视角。


26个正常结肠上皮高表达并在胃癌细胞中上调的基因。NAT，胃癌癌旁正常上皮细胞

通过联合单细胞表观组数据分析发现，基因启动子区域染色质可及性和DNA甲基化水平的异常改变可能解释部分基因在胃癌细胞中表达量的异常改变，为理解胃癌发生过程中基因表达异常的表观遗传学调控提供了重要线索。


代表性基因的表达水平与启动子DNA甲基化和启动子染色质可及性

2、系统绘制了胃癌的单细胞DNA甲基化图谱


多个胃癌患者共有的胃癌细胞中异常甲基化的基因（启动子区域）

该研究系统绘制了胃癌单细胞DNA甲基化图谱，确认了胃癌在肿瘤发生过程中癌细胞经历了全基因组范围的大规模DNA去甲基化，特别是在重复元件LINE、SINE、LTR和Satellite等基因组区域DNA去甲基化幅度更大，并且在不同患者间和同一患者内均具有强烈异质性。相比于结直肠癌，胃癌的基因组去甲基化幅度更大。其中，胃癌细胞基因组中LINE-1的DNA甲基化水平强烈下降，同时LINE-1编码的ORF1p蛋白异常上调表达，提示部分逆转录转座子LINE-1很可能在胃癌细胞中被异常激活转录和转座，进而破坏基因组完整性。

该研究鉴定了多个患者共有的胃癌细胞特异高甲基化或特异性低甲基化的基因（启动子区域），这些基因可作为候选的胃癌DNA甲基化标志物，例如异常高甲基化的TMEM240和HAGLROS基因的启动子区域，以及异常低甲基化的TRPM2-AS和HRH1基因的启动子区域。这一发现有望为胃癌的临床诊断提供理论依据。

3、揭示了混合型胃癌癌细胞遗传克隆、DNA甲基化亚群以及转录组亚群之间的复杂交互关系

鉴于混合型胃癌的肿瘤异质性极强，该研究采取多点取样以及单细胞多组学测序方案，为探究混合型胃癌癌细胞的空间位置、遗传克隆、DNA甲基化亚群以及基因表达亚的交互关系提供了坚实基础。首先，通过染色体拷贝数变异模式准确鉴定同一个患者体内的癌细胞的遗传谱系，发现DNA甲基化亚群与遗传克隆高度吻合，在同一个患者体内同一个遗传克隆内的不同癌细胞的DNA甲基化水平相似，而不同遗传克隆癌细胞的DNA甲基化水平常常差异很大。这说明全基因组去甲基化在胃癌遗传克隆形成的时候已经基本确立，而在后续的克隆扩张过程中可维持相对稳定。


DNA甲基化的层次聚类分群与遗传克隆一致

然而，同一个胃癌患者体内癌细胞的遗传克隆或者DNA甲基化亚群与转录组亚群之间并非简单的一一对应关系，同一个遗传克隆的癌细胞可以对应多个转录组亚群，不同遗传克隆的癌细胞也可以对应同一个转录组亚群。此外，混合型胃癌呈现出强烈的空间异质性，不仅同一患者不同取样位置包含的癌细胞遗传克隆、DNA甲基化亚群和转录组亚群可以存在差异，同一取样位置内部也可以含有多个不同的遗传克隆、DNA甲基化亚群或转录组亚群。


遗传谱系、转录组亚群和取样位置的对应情况

4、联合单细胞多组学数据分析、多点取样及点对点组织病理学分析精准鉴定混合型胃癌不同分化状态癌细胞的多个组学层面的关键分子特征及免疫微环境特点

该研究通过分析不同胃癌转录组亚群的特征基因，鉴定出每个转录组亚群癌细胞的分化状态，包括腺癌、神经内分泌癌和肝样胃癌，并且与同一采样位点的病理分析结果基本吻合。此外，将腺癌进一步细分为不同的分化程度（高分化、中分化和低分化）是一件颇具挑战性的工作，主要原因包括：（1）由于胃癌患者间异质性强烈，目前仍缺乏已知、通用的可用于鉴定腺癌内部不同分化程度肿瘤的标志基因；(2) 尽管每个取样部位的病理分析结果可以提供有力证据，但同一个取样部位内部依然可能存在空间异质性。针对这一问题，该研究充分发挥多点取样、同一采样位点病理分析及单细胞多组学数据分析的联合优势，在UMAP分群受患者间异质性影响较大的情况下，采用PCA的PC3轴将每个混合型胃癌患者体内癌细胞的不同分化状态的转录组亚群区分开，包括区分腺癌内部不同的分化程度（高分化、中分化和低分化），并与同一采样位点的病理分析结果基本吻合。


对混合型胃癌患者单细胞转录组数据的PCA降维结果

在准确鉴定癌细胞不同分化状态的基础上，该研究进一步探究了不同分化状态癌细胞的分子特征。结果发现，粘蛋白家族成员MUC1在中分化和高分化腺癌中高表达，在每个患者体内随着分化状态变差其表达量显著降低。纤连蛋白FN1在分化状态较差（神经内分泌癌和肝样胃癌）的癌细胞中表达量显著升高。并且，基因启动子区域染色质可及性和DNA甲基化的改变可以部分解释部分基因在不同分化状态间表达水平的差异。此外，尽管胃癌分化状态的特征基因在患者间表现出强烈异质性，却可以汇聚到一些共性的信号通路上。例如，每个患者体内分化状态较差的癌细胞上调的基因富集在细胞周期、应激反应等相关通路，而每个患者体内分化状态较好的癌细胞上调的基因富集在免疫相关通路。


MUC1和FN1蛋白的免疫组化结果。ADC，腺癌；NEC，神经内分泌癌；HAS，肝样胃癌

该研究发现，对于多数混合型胃癌患者（5/6）的原发灶癌细胞，分化状态较差的癌细胞的全基因组DNA甲基化水平显著高于分化状态较好的癌细胞，但仍低于正常胃上皮细胞。该结果提示胃癌在肿瘤发生早期发生的大规模全基因组去甲基化使得以LINE-1为代表的重复序列被异常转录，激活了胃癌细胞作为上皮细胞的抗原递呈特性，使得免疫细胞可以识别这些癌细胞。而在这些癌细胞进一步去分化或者转分化（变成神经内分泌癌或者肝样胃癌）过程中其全基因组甲基化水平部分回调，可能部分抑制了重复序列的异常转录，降低了癌细胞的抗原递呈特性，从而使得免疫细胞更难识别和攻击这些低分化或者转分化的癌细胞。


每个胃癌患者体内不同分化状态的原发灶癌细胞的全基因组DNA甲基化水平

通过在同时含有腺癌和非腺癌的混合型胃癌内部进行比较，发现非腺癌（神经内分泌癌和肝样胃癌）内部的CD8+T细胞浸润水平较低，CD8+T细胞主要存在于肿瘤边缘，呈现出免疫排斥型的免疫微环境特征。相反，腺癌内部的CD8+T细胞浸润水平相对较高。相应地，腺癌部分的免疫相关通路评分也显著高于非腺癌（神经内分泌癌和肝样胃癌）部分。


 一例代表性的混合性腺神经内分泌癌的CD8免疫组化结果

总之，该研究通过对胃癌根治手术标本中配对的癌旁、原发灶、淋巴结转移灶进行系统性多点采样和单细胞多组学（基因组、DNA甲基化组、染色质状态组以及转录组）测序分析，揭示了不同胃癌患者癌细胞基因表达异常的共性规律，发现不同分型的胃癌都普遍高表达肠上皮细胞特异性基因，这反映了胃癌细胞在失去正常生理功能的去分化过程中其可塑性也普遍增加。系统绘制了胃癌的单细胞DNA甲基化图谱，发现胃癌与结直肠癌类似，在肿瘤发生过程中其癌细胞经历了全基因组范围的大规模DNA去甲基化，同时少量基因的启动子区域发生DNA甲基化异常上调；发现与结直肠癌类似，在同一胃癌中同一个遗传克隆内的不同癌细胞的DNA甲基化水平相似，而不同遗传克隆癌细胞的DNA甲基化水平常常差异很大。这说明全基因组DNA去甲基化在胃癌肿瘤发生相对早期的阶段就完成了，并在此后每个遗传克隆的扩张过程中基本维持不变。发现同一胃癌中癌细胞的遗传克隆或者DNA甲基化亚群与转录组亚群之间并非简单的一一对应关系，同一个遗传克隆的癌细胞可以对应多个转录组亚群，不同遗传克隆的癌细胞也可以对应同一个转录组亚群；发现在混合型胃癌中，相比于分化状态较好的癌细胞，分化状态较差（例如神经内分泌癌、肝样胃癌）的癌细胞部分回调全基因组甲基化，上调细胞周期、应激反应等相关通路基因，下调免疫相关通路基因，免疫浸润水平较低。

北京大学卞舒惠博士（现为南京医科大学生殖医学国家重点实验室教授）、王艺橙博士、周圆博士为本文共同第一作者，汤富酬和北京大学第三医院周鑫副研究员为本文的共同通讯作者。该研究工作得到国家自然科学基金委员会、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心等经费资助。