近日，化学分析领域权威期刊《Analytical Chemistry》和《Sensors and Actuators: B. Chemical》在线发表了上海交通大学生命科学技术学院张大兵团队杨立桃教授课题组的研究成果“One Versatile Cas9-Integrated Single-Tube Duplex Quantitative Real-Time PCR System for Rapid Analysis of CRISPR/Cas-Induced Mutants”和“In vitro Argonaute cleavage-mediated quantitative PCR facilitates versatile CRISPR/Cas-induced mutant analysis”。上海交通大学生命科学技术学院硕士研究生李雪奇、王艺洁和博士后李荣为第一作者和共同第一作者，生命科学技术学院杨立桃教授为通讯作者。生命科学技术学院袁政教授和张大兵教授参与合作研究。

CRISPR/Cas9基因编辑系统已成为基因功能研究和动植物快速育种的主要技术手段之一。CRISPR/Cas9对目的位点的编辑一般会出现不同的编辑类型，如杂合子、纯合子或嵌合基因型等。因此，如何快速的对基因编辑产生的突变体材料进行快速、准确的筛选十分重要。团队分别利用核酸序列引导性核酸酶CRISPR/Cas9和原核生物Thermus thermophilus Argonaute （TtAgo），将体外基因组核酸酶剪切反应与荧光定量PCR和数字PCR相融合，建立了多功能的基因编辑作物突变体的筛选、分型和效率精确定量分析方法，并成功应用于基因编辑水稻突变体的筛选和分析。

Cc-qPCR:

基于Cas9/sgRNA复合体的特异性序列识别和剪切特性，设计了一种CRISPR/Cas9体外剪切和双重qPCR检测相结合的方法，命名为Cc-qPCR。该方法的主要原理是在体外用Cas9/sgRNA剪切待测样品的基因组DNA，然后以剪切后的基因组DNA为模板，利用qPCR进行扩增，最后根据扩增结果对待测样品进行筛选、分型和定量（图1）。


Cc-qPCR技术原理

为了验证Cc-qPCR在实际样本中检测能力，对24个基因编辑水稻样本(W1-W24)进行了分析，成功筛选出21个编辑样本，并确定了17个为纯合基因型，4个为杂合基因型，筛选和分型结果与Sanger测序结果完全一致。对3个混合样本的基因编辑频率分别定量为35.82%、8.68%和92.10%，与预期结果相吻合，表明Cc-qPCR能够准确地计算出基因编辑的频率。

SMART：

基于TtAgo/gDNA复合体的特异性序列识别和剪切特性，设计了一种TtAgo体外剪切和qPCR/ddPCR检测相结合的方法，命名为SMART。该方法的主要原理是在体外用TtAgo/gDNA剪切待测样品的基因组DNA，然后以剪切后的基因组DNA为模板，利用qPCR/ddPCR进行扩增，最后根据扩增结果对待测样品进行筛选、分型和定量分析（图2）。采用RdDM3l (RNA-directed DNA methylation 3-like)基因编辑水稻突变体为材料，系统地验证了SMART方法的可行性和适用性，优化了SMART方法的工作条件，系统评价了SMART方法的特异性、灵敏度和准确性。RdDM3l基因编辑水稻后代品系的SMART检测结果与实际相吻合，在混合样本检测中，其灵敏度达到0.5%，可准确评估基因编辑效率。研究结果表明，相比现有的突变体检测方法，SMART能够识别单碱基替换突变体，具有更高的分辨率和准确性。

SMART工作原理示意图

研究建立的Cc-qPCR和SMART方法，sgRNA和gDNA设计简便，实现了对未知的基因编辑突变体进行筛选、突变基因分型和评估基因编辑频率。在实际样本检测中，也充分展现了分辨率高、准确度高、实验操作简单等优点，适用于分子育种过程中的突变体的快速、准确筛选。Cc-qPCR和SMART方法也有潜力被进一步用于临床突变基因、肿瘤标志物SNVs等检测领域。

本研究得到了国家重大专项、上海市科委农业领域项目、上海市东方学者计划的资助。

论文链接：

Cc-qPCR论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c01837

SMART论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0925400522014241